Tổng quan về Rối loạn hệ gen (Genomic Disorders)

Rối loạn hệ gen là gì?

Rối loạn hệ gen (Genomic Disorders) là các tình trạng bệnh lý gây ra do bị mất hoặc dư thừa vật chất di truyền (nhiễm sắc thể và ADN), hay còn được gọi là các biến thể bản sao (copy number variations - CNVs).

Có một số rối loạn hệ gen đã được mô tả rõ ràng và có thể được chia thành hai loại:

• rối loạn do mất số lượng bản sao (hội chứng xóa)
• rối loạn do tăng số lượng bản sao (hội chứng trùng lặp)

Phân loại các biến thể số lượng bản sao

Biến thể cấu trúc

Biến thể di truyền cấu trúc đề cập đến một loại thay đổi trình tự thường bao gồm hơn 1000 cặp bazơ (một kilobase DNA hoặc kb).

Tuy nhiên, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng những biến thể di truyền này có thể nhỏ hơn trong phạm vi lên tới 450 cặp bazơ và hầu hết các cá nhân đều có ít nhất 1000 biến thể như vậy.

Những biến thể di truyền cấu trúc này bao gồm:

• Các biến thể định lượng như biến thể số bản sao (CNV).
• Sắp xếp lại trình tự (chẳng hạn như những gì được quan sát thấy trong các globulin miễn dịch).
• Các biến thể ít phổ biến khác, bao gồm sắp xếp lại nhiễm sắc thể có thể hoặc không làm thay đổi nội dung bộ gen nhưng có thể phá vỡ chức năng gen và dẫn đến bệnh tật.

CNV

CNV là loại biến thể cấu trúc phổ biến nhất. Chúng là các đoạn ADN trải dài từ hàng nghìn đến hàng triệu bazơ và có số lượng bản sao khác nhau giữa các cá thể khỏe mạnh khác nhau.

Người ta ước tính rằng 50% bộ gen được cấu thành bởi các trình tự lặp lại. Các CNV này có thể tái phát khi được trung gian bởi các khu vực nơi số lần lặp lại bản sao thấp chia sẻ hơn 90% danh tính hoặc nơi các bản sao đoạn ngắn có kích thước vượt quá 1 kilobase. Các CNV khác có thể không tái diễn và liên kết với các đầu cùn của ADN, các vi tương đồng hoặc thậm chí là các phần chèn vào có thể dẫn đến sự sắp xếp lại phức tạp hơn.

Những khác biệt về gen dưới kính hiển vi này về số lượng bản sao của một hoặc nhiều đoạn ADN là kết quả của việc tăng hoặc giảm ADN.

• Gains – Tăng số lượng bản sao có thể là kết quả của sự trùng lặp, nhân ba hoặc thậm chí tăng số lượng bản sao nhiều lần.
• Losses - Hầu hết việc xóa bỏ là kết quả của việc mất số lượng bản sao ở một locus (xóa dị hợp tử), nhưng trong một số trường hợp, sự mất mát có thể ảnh hưởng đến các bản sao ở cả hai locus (xóa đồng hợp tử).
• Transmission - CNV thường được kế thừa nhưng có thể xảy ra mới (như một sự kiện mới). Ban đầu đây được coi là những sự kiện hiếm gặp do (các) đột biến lẻ ​​tẻ và có liên quan đến các bệnh di truyền Mendel cụ thể. Những nhận thức sai lầm về sự hiếm gặp và mối liên kết bệnh tuyệt đối của chúng chủ yếu là do những hạn chế về mặt kỹ thuật ngăn cản việc đánh giá toàn bộ bộ gen trong các đoàn hệ lớn. Những tiến bộ trong công nghệ đã chỉ ra rằng sự sai lệch so với trạng thái lưỡng bội là phổ biến và góp phần đáng kể vào sự đa dạng di truyền. Một số nghiên cứu cho rằng sự khác biệt về CNV trong bộ gen của con người lên tới 20%, mặc dù đây có thể là một sự đánh giá quá cao và có thể gần tới 5%. Người ta ước tính một cách thận trọng rằng hầu hết các cá nhân đều mang trung bình ba CNV quy mô lớn. Số lượng CNV được biết đến góp phần gây bệnh tiếp tục tăng.
• Hotspots - Sự phân bố vật lý của CNV dường như không ngẫu nhiên trên toàn bộ hệ gen, với cả điểm nóng và điểm lạnh của CNV được báo cáo. Tần số CNV lớn nhất ở các vùng nhân đôi phân đoạn (làm giàu gấp 4 đến 10 lần đối với CNV), phù hợp với sự tái tổ hợp tương đồng không allelic như một cơ chế chính gây ra CNV. CNV thường được quan sát thấy ở những vùng giàu gen. CNV dường như được làm giàu trong các họ gen cụ thể, bao gồm các gen phản ứng miễn dịch và viêm, tín hiệu tế bào và phân tử kết dính tế bào, protein cấu trúc và thụ thể khứu giác. Hầu hết những khác biệt này có thể đại diện cho các CNV lành tính phản ánh sự biến đổi bình thường mà không có hậu quả lâm sàng rõ ràng.
• Pathogenicity (khả năng gây bệnh) - CNV có thể gây bệnh nếu chúng liên quan đến các gen nhạy cảm với liều (không đủ đơn bội hoặc nhạy cảm gấp ba) hoặc nếu chúng ảnh hưởng hoặc phá vỡ các vùng gen thông qua các yếu tố điều hòa. Thông tin về độ nhạy liều lượng gen có thể được tham vấn trong cơ sở dữ liệu được quản lý như ClinGen. Một số CNV gây bệnh gây ra các rối loạn hội chứng với các đặc điểm kiểu hình nhất quán (ví dụ, xóa gen đàn hồi trong hội chứng Williams, sao chép gen PMP22 trong bệnh Charcot-Marie-Tooth loại 1A [CMT1A]), trong khi các CNV khác có liên quan đến tính nhạy cảm hoặc kháng bệnh (ví dụ như ung thư, nhiễm HIV, rối loạn tự miễn dịch, tự kỷ).

Mendelian disease associations

CNV có thể là nguyên nhân gây ra các bệnh Mendelian liên quan đến sự tăng và giảm vật liệu di truyền, ngay cả ở cấp độ exonic. Ví dụ bao gồm những điều sau đây:

• Việc xóa hoặc sao chép gen liền kề như đã thấy trong hội chứng Williams-Beuren, hội chứng xóa 22q11, hội chứng Smith-Magenis và hội chứng Potocki-Lupski. Đây là những ví dụ về CNV tái phát và qua trung gian tái tổ hợp tương đồng không allelic (NAHR) xảy ra tại các vị trí lặp lại bản sao thấp. 
• Việc xóa các gen hoặc một phần gen (exon) dẫn đến các rối loạn di truyền do di truyền Mendel, bao gồm các rối loạn di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường (ví dụ, xóa gen CREBBP trong hội chứng Rubinstein-Taybi) và bệnh lặn liên kết với X (ví dụ, xóa dystrophin gen gây bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne).

Sự liên quan tới các tính trạng phức tạp

CNV cũng có thể liên quan đến những đặc điểm hoặc hội chứng phức tạp hơn trong đó có sự kết hợp của các yếu tố di truyền và môi trường.

Ví dụ bao gồm một số rối loạn liên quan đến bệnh tự viêm. Một số CNV này và mối liên quan của chúng với bệnh tật đã được các nghiên cứu khác lặp lại nhưng không phải lúc nào cũng được cho là có ý nghĩa và có lẽ có thể phụ thuộc vào đối tượng nghiên cứu.

• Việc mất vị trí thành phần bổ thể 4 (C4) gây nguy cơ mắc bệnh lupus ban đỏ hệ thống gấp 1,6 đến 5,3 lần.
• Việc xóa FCGR3B liên quan đến bệnh u hạt với viêm đa mạch và các tình trạng viêm/tự miễn dịch khác như viêm khớp dạng thấp.
• Việc xóa defensin-beta 4 (DEFB4) có liên quan đến việc tăng nguy cơ mắc bệnh Crohn đại tràng. Việc xóa 20 kb ngược dòng của gen IRGM cũng có liên quan đến bệnh Crohn và bệnh vẩy nến.
• Việc xóa 32 kb liên quan đến hai gen mã hóa protein vỏ (LCE3B và LCE3C) có liên quan đến yếu tố nhạy cảm đối với bệnh vẩy nến. Việc xóa DEFB4 cũng có liên quan đến bệnh viêm khớp vẩy nến.
• Một ví dụ khác về các rối loạn phức tạp bao gồm tần số CNV dòng mầm de novo tăng lên ở bệnh nhân mắc chứng rối loạn phổ tự kỷ (ASD) và tâm thần phân liệt. Các CNV trong nhiều khu vực của bộ gen người có khả năng liên quan đến sinh bệnh học tự kỷ đã được mô tả.

Ngoài ra, một số tình trạng bệnh lý khác cũng có liên quan đến nhiều CNV, điều này có thể giải thích các kiểu hình khác nhau của chúng. Ví dụ, trong một nghiên cứu hồi cứu, phương pháp lai gen so sánh mảng (array comparative genomic hybridization - CGH) đã được sử dụng để đánh giá CNV ở 2312 trẻ khuyết tật phát triển đã có một CNV được xác định trước và ở 8329 trẻ không bị khuyết tật phát triển. Nghiên cứu này cho thấy, so với các biện pháp kiểm soát không có khuyết tật phát triển, những người khuyết tật phát triển có số lượng CNV bổ sung tăng lên. Sự gia tăng CNV này có thể đóng vai trò nguyên nhân gây ra tình trạng khuyết tật (ví dụ: bằng cách gây ra sự gián đoạn của gen mới hoặc thay đổi liều lượng gen) hoặc có thể là một dấu hiệu gián tiếp về tính nhạy cảm đối với tổn thương gen.

Nguyên nhân tạo ra các CNV

Số lần lặp lại bản sao thấp là các chuỗi ADN lặp đi lặp lại (sao chép đoạn) có kích thước khoảng 10 đến 300 kilobase có chung mức độ tương đồng ≥95%.

Việc ghép cặp sai các vùng có tính tương đồng cao này có thể gây ra sự sai lệch và tái tổ hợp không đồng đều trong quá trình phân bào. Điều này có thể dẫn đến sự sao chép và xóa vật liệu nhiễm sắc thể dẫn đến CNV. Quá trình này được gọi là tái tổ hợp tương đồng không allelic (NAHR), cơ chế phổ biến nhất để hình thành sự sắp xếp lại bộ gen.

Hình 1: Tái tổ hợp tương đồng không allelic (NAHR)

(A) Tái tổ hợp cân bằng (quy trình bình thường) – Các vòng tròn có nhãn A và B đại diện cho LCR, được định nghĩa là các chuỗi DNA lặp lại có kích thước> 10 kb với độ đồng nhất trình tự 97%. Các LCR nằm trong cùng một nhiễm sắc thể và được sắp xếp định hướng trực tiếp và cách nhau 5 Mb. Sự tái tổ hợp sẽ diễn ra chính xác và khiến thông tin di truyền A và B (hình chữ nhật màu xanh) hoán đổi vị trí (tức là di chuyển đến các chuỗi DNA đối diện).
(B) Lỗi giảm phân – A và B, đại diện cho các LCR có tính tương đồng tương tự, ghép cặp sai và dẫn đến vật liệu trùng lặp ở dải trên và vật liệu bị xóa ở dải dưới.
(C) Tái tổ hợp PMP22 bất thường – Tái tổ hợp bất thường, dẫn đến sự trao đổi DNA mất cân bằng dẫn đến nhân đôi PMP22 , gây ra bệnh Charcot-Marie-Tooth. Sự tái tổ hợp bất thường dẫn đến việc xóa PMP22  gây ra bệnh lý thần kinh di truyền dẫn đến liệt do áp lực (HNPP, bệnh lý thần kinh tomaculous).

PMP22: gen myelin protein-22 ngoại vi; LCR: lặp lại bản sao thấp; Kb: kilobase; Mb: megabase.

NAHR có thể dẫn đến việc xóa hoặc sao chép thông qua các cơ chế tương tự và do sự lặp lại bản sao thấp qua trung gian tái tổ hợp tương đồng không tương đồng. Một ví dụ điển hình là trường hợp của Charcot-Marie-Tooth Type I, một bệnh lý thần kinh ngoại biên do sự sao chép của gen PMP22 trên nhiễm sắc thể 17p11.2. Cùng một khu vực khi bị xóa sẽ dẫn đến một bệnh lý thần kinh khác được gọi là bệnh lý thần kinh Tomaculous, còn được gọi là bệnh lý thần kinh di truyền có khả năng gây liệt do áp lực (HNPP).

Các cơ chế khác dẫn đến CNV bao gồm nối đầu không tương đồng và sao chép gây ra đứt gãy qua trung gian vi mô, mặc dù việc thảo luận về những điều này nằm ngoài phạm vi của bài viết này.

Mặc dù có rất nhiều kiến ​​thức về các chi tiết cấu trúc về cách thức CNV xảy ra, chúng tôi không biết điều gì khiến một số cá nhân phát triển những thay đổi này nhiều hơn những cá nhân khác.

Điều đáng quan tâm là trong một nghiên cứu lớn về bệnh nhân khuyết tật phát triển, dữ liệu của cha mẹ đã cung cấp thông tin về việc liệu CNV có được di truyền hay phát sinh mới. Nghiên cứu này cho thấy rằng CNV có nhiều khả năng phát sinh mới trong các rối loạn hội chứng (ví dụ, hội chứng Williams-Beuren), trong khi CNV có nhiều khả năng di truyền hơn trong các rối loạn có kiểu hình thay đổi (ví dụ, thiểu năng trí tuệ). Một lời giải thích tiềm năng có thể là khả năng sinh sản bị giảm ở những người mắc chứng rối loạn hội chứng nghiêm trọng hơn.

Interpreting CNVs

Việc giải thích CNV đã được cải thiện đều đặn do sử dụng cơ sở dữ liệu điều khiển lớn cho phép so sánh trực tiếp với các điều khiển có vẻ bình thường.

Ví dụ về các cơ sở dữ liệu này bao gồm Cơ sở dữ liệu về các biến thể gen Database of Genomic Variants (DGV), các dự án giải trình tự lớn như Dự án 1000 bộ gen hoặc ClinVar. Các cơ sở dữ liệu khác bao gồm thông tin về kiểu hình, chẳng hạn như DECIPHER (DatabasE of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensembl Resources), đang trở thành nguồn tài nguyên quý giá cho những phát hiện được phát hiện bằng phương pháp lai gen so sánh mảng. DECIPHER là một nguồn tài nguyên dựa trên web chứa dữ liệu lâm sàng và mảng được lưu giữ bởi hơn 247 trung tâm thành viên trên toàn thế giới. Nghiên cứu Giải mã Rối loạn Phát triển được thực hiện ở Vương quốc Anh đã đánh giá 14.000 trẻ em bị chậm phát triển nghiêm trọng và cha mẹ của chúng bằng phương pháp giải trình tự microarray và exome. Những nghiên cứu quy mô lớn này là công cụ cực kỳ có giá trị để giải thích dữ liệu CNV. Một công cụ phổ biến khác có sẵn để quản lý CNV và hàm lượng gen của chúng là ClinGen . Đây là nguồn tài nguyên bộ gen lâm sàng mở giúp thiết lập chú thích thích hợp về CNV dựa trên thông tin được đánh giá từ nhiều nguồn tài nguyên theo cấp độ và được các chuyên gia quản lý.

Việc giải thích khả năng gây bệnh của CNV có thể khá khó khăn khi có nhiều CNV ở một cá thể. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhiều CNV hiếm gặp, do di truyền hoặc mới phát, có thể làm tăng thêm mức độ nghiêm trọng trên lâm sàng. Điều quan trọng là phải nhấn mạnh sự hiện diện của các CNV phổ biến trong dân số nói chung. Không rõ liệu nhiều dạng đa hình phổ biến này có thể đóng vai trò trong các rối loạn thông thường hay không.

Cơ chế gây rối loạn hệ gen

Có nhiều cơ chế tiềm tàng khác nhau có thể dẫn đến bệnh tật trong các rối loạn hệ gen thứ phát do mất đoạn và sao chép.

Cơ chế chính liên quan đến sự thay đổi gen nhạy cảm với liều lượng. "Sự đơn bội" ("haplo" có nghĩa là một nửa) định nghĩa khái niệm trong đó việc mất hoặc tăng một alen của gen có thể dẫn đến việc sản xuất hoặc chức năng protein bất thường, do đó gây ra bệnh tật.

Việc xóa bỏ có thể ảnh hưởng đến lượng protein cần thiết, dẫn đến bệnh tật. Một ví dụ là hội chứng Williams-Beuren, gây ra bởi một đoạn vi mất đoạn trong nhiễm sắc thể 7q11.23 liên quan đến nhiều gen, bao gồm cả gen đàn hồi. Chỉ có một nửa liều Elastin bình thường cũng đủ gây đứt gãy các sợi đàn hồi của động mạch, dẫn đến hẹp động mạch chủ và nhiều bất thường khác về động mạch. Việc mất đoạn trong hội chứng Williams-Beuren, tương tự như những gì xảy ra trong nhiều rối loạn gen khác, có thể có kích thước khác nhau. Sự mất mát thường bao gồm 1,55 Mb, nhưng trong một số trường hợp, việc xóa có thể rộng hơn hoặc thậm chí nhỏ hơn. Sự khác biệt về kích thước là do các LCR khác nhau xung quanh khu vực quan trọng có thể tham gia vào việc điều hòa việc sắp xếp lại.

Tầm quan trọng của liều lượng gen trong việc xác định tác dụng của CNV được minh họa qua sự khác biệt giới tính từ một nghiên cứu lớn về CNV ở bệnh nhân khuyết tật phát triển. Khi so sánh với nữ giới, nam giới có nhiều "rối loạn gen kiểu hình khác nhau" (ví dụ như thiểu năng trí tuệ) nhưng không có rối loạn hội chứng (ví dụ: rối loạn phổ tự kỷ). Phụ nữ có thể được bảo vệ khỏi những rối loạn đa yếu tố di truyền hơn do sự sai lệch nhiễm sắc thể giới tính (nghĩa là bảo vệ phụ nữ khỏi các đột biến có hại yếu trên một nhiễm sắc thể X bởi các gen tương ứng bình thường trên nhiễm sắc thể X khác).

Sự sao chép có thể gây bệnh nếu các gen liên quan đến quá trình sao chép có tính nhạy ba lần hoặc nếu việc tăng số lượng bản sao làm gián đoạn khung đọc của gen, dẫn đến quá trình tổng hợp protein bất thường. Một cơ chế khác bao gồm việc bộc lộ các alen lặn. Khi một alen lặn bị xóa, nó có khả năng phát hiện ra một biến thể gây bệnh trong bản sao (gen) còn lại trên nhiễm sắc thể kia. Điều này sẽ dẫn đến bệnh tật vì không còn bản sao hoạt động bình thường cho gen bị ảnh hưởng.

Các cơ chế gây bệnh khác bao gồm:

• Can thiệp vào các yếu tố điều hòa bên ngoài gen, như ở loại A2 thuộc loài brachydactyly và sự sao chép bên ngoài gen BMP2.
• Sự can thiệp vào các gen in dấu, như trong trường hợp nhân đôi của người cha ở 11p15 dẫn đến hội chứng Beckwith-Wiedemann.

Các mảng chứa đa hình nucleotide đơn (SNP) có thể hỗ trợ thêm trong việc xác định các rối loạn in dấu gây ra bởi sự phân ly đơn bào. Một ví dụ như vậy là hội chứng Angelman và sự mất cân bằng một cha mẹ (UPD) do sự đồng phân. Đồng đẳng là kết quả của sự không phân ly trong giảm phân II hoặc do nhân đôi sau hợp tử (cứu hộ thể đồng thể).

Một số ít trường hợp mắc hội chứng Angelman là kết quả của UPD. Trong những trường hợp đó, không có sự đóng góp của người mẹ đối với vùng nhiễm sắc thể 15 (15q11-q13). Những trường hợp này thường liên quan đến việc giải cứu nhiễm sắc thể đơn nhân (sự nhân đôi của nhiễm sắc thể từ hợp tử đơn nhiễm sắc thể 15), trong đó có hai bản sao giống hệt nhau của nhiễm sắc thể 15 của người cha và không có sự đóng góp của người mẹ. Các ví dụ khác về UPD có thể được thấy trong hội chứng Prader-Willi.

Contiguous gene syndromes

Hội chứng gen tiếp giáp có thể xảy ra khi CNV lớn ảnh hưởng đến một số gen tiếp giáp.

Một số ví dụ về hiện tượng gen tiếp giáp này:

• Hội chứng Williams-Beuren, còn gọi là hội chứng Williams, là do mất 1,5-1,8 Mb trên nhiễm sắc thể 7q11, thường bao gồm 26 đến 28 gen.
• Trong hội chứng WAGR (Wilms tumor, Aniridia, Genitourinary anomalies, and mental Retardation), các đặc điểm lâm sàng là do mất các gen riêng lẻ do mất một lượng lớn: việc xóa WT1 là nguyên nhân gây ra khối u Wilms, trong khi việc xóa PAX6 là nguyên nhân gây ra khối u Wilms. cho những phát hiện về aniridia. Cả hai gen đều nằm liền kề trong nhánh ngắn của nhiễm sắc thể 11.

Các phương pháp phát hiện rối loạn hệ gen

Các rối loạn về hệ gen thường được điều tra và phát hiện bằng phương pháp lai gen so sánh mảng (array CGH).

Mức tăng hoặc giảm được phát hiện trên một mảng có thể được xác nhận bằng một phương pháp độc lập như lai huỳnh quang tại chỗ (FISH), khuếch đại đầu dò phụ thuộc nhiều lần thắt (MLPA) hoặc PCR định lượng (Q-PCR).

Xét nghiệm FISH của cha mẹ hoặc xét nghiệm array CGH có thể được xem xét trong các trường hợp có bất thường về gen chọn lọc có thể di truyền hoặc để giải thích các CNV là các biến thể có ý nghĩa không chắc chắn và hỗ trợ cho việc giải thích lâm sàng. Điều này có liên quan đến việc mang thai và kế hoạch hóa gia đình trong tương lai.

Trong khi vị trí bộ gen của sự mất mát được xác định rõ ràng bằng thử nghiệm mảng, thì lợi ích có thể là sao chép hoặc chèn vào song song. Nếu vấn đề thứ hai phát sinh do hậu quả của sự chuyển vị chèn vào của cha mẹ (IT), điều này có thể có ý nghĩa quan trọng đối với việc mang thai trong tương lai. Trong trường hợp này, FISH có thể được sử dụng để xác định bản chất và nội địa hóa của việc tăng số lượng bản sao.

Công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) được sử dụng để giải trình tự exome cũng phù hợp để xác định CNV nhưng không được sử dụng rộng rãi cho mục đích này. Giải trình tự toàn bộ exome (WES) có thể phát hiện đồng thời các CNV và các biến thể trình tự.

Phép lai hệ gen so sánh mảng (Array comparative genomic hybridization)

Phép lai hệ gen so sánh mảng (array CGH), còn được gọi là lai genome so sánh dựa trên nhiễm sắc thể hoặc microarray, là xét nghiệm tiêu chuẩn vàng trong phòng thí nghiệm để phát hiện CNV gây rối loạn gen. Xét nghiệm array CGH cho phép phát hiện những tổn thất nhỏ hoặc tăng thêm của vật liệu gen xuống vài kilobase (kb) xuống mức exonic. Nó được sử dụng rộng rãi trong việc đánh giá bệnh nhân thiểu năng trí tuệ và/hoặc dị tật bẩm sinh.

Hình 2: Sơ đồ lai hệ gen so sánh để thiết lập microarray
Reproduced from: Beheshti B, Park PC, Braude I, Squire JA. Micorarray CGH. In: Molecular Cytogenetics: Protocols and Applications. Humana Press, 2002, with kind permission from Springer Science + Business Media B.V. Copyright © 2002.

CGH: comparative genomic hybridization; BAC: bacterial artificial chromosome; PAC: P1 bacteriophage artificial chromosome; P1: P1 bacteriophage; Cy3: cyanine dye with green fluorescence; Cy5: cyanine dye with red fluorescence.

Sơ đồ biểu diễn kỹ thuật mảng CGH để phân tích tập trung vào sự mất cân bằng số lượng bản sao dọc theo vùng quan tâm (ví dụ: 8q21.1). Một đường dẫn các dòng vô tính gen (ví dụ: BAC, PAC, PI, cosmid) được tạo ra để bao phủ khu vực. Sau khi tách chiết và tinh chế, các mục tiêu ADN hệ gen này được sắp xếp trên các phiến kính.

Xét nghiệm array CGH được thực hiện bằng cách lai ADN hệ gen bình thường (Cy3) và khối u (Cy5) được dán nhãn vào microarray và được phát hiện bằng máy quét microarray. Mỗi vị trí mảng, được sắp xếp lại trong silico dưới dạng một bản đồ liền kề duy nhất để tương ứng với đường lát gạch, có thể được phân tích bằng tỷ lệ huỳnh quang để xác định các vùng thay đổi số lượng bản sao. Những kết quả này có thể tương quan với các kỹ thuật silico để xác định các gen ứng cử viên quan tâm.

Hai nền tảng chính hiện được sử dụng để phát hiện CNV là mảng oligonucleotide (oligonucleotide là các đoạn ADN có từ 25 đến 60 cặp bazơ) và mảng đa hình nucleotide đơn (array SNP) ]. Có khoảng 10 triệu SNP đa hình trong toàn bộ bộ gen của con người.

Cả array SNP và oligonucleotide đều có thể phát hiện các biến thể về số lượng bản sao, nhưng mảng SNP có thể được sử dụng ngoài ra để xác định tình trạng không có dị hợp tử hoặc sự hiện diện của đồng hợp tử, như đã thấy trong các trường hợp có quan hệ họ hàng và trong trường hợp cha mẹ mất một cặp vợ chồng khi có sự kế thừa các vùng hoặc toàn bộ nhiễm sắc thể từ một bố/mẹ thay vì sự đóng góp của cả bố và mẹ thông thường.

SNP cũng có thể phát hiện tình trạng mất tính dị hợp tử (LOH) thường thấy ở những thay đổi của tế bào ung thư soma. SNP cũng có thể rất hữu ích trong việc phát hiện bệnh khảm soma, tình huống trong đó có thể có hai hoặc nhiều dòng tế bào trong một cá thể và thể tam bội, một trường hợp hiếm gặp khi có thể có tổng cộng 69 nhiễm sắc thể (3 bộ đơn bội) có thể được phát hiện trong bối cảnh trước khi sinh. Một số nền tảng hiện nay đang kết hợp việc sử dụng mảng CGH và SNP được tích hợp trong một nền tảng duy nhất.

Các kỹ thuật chẩn đoán phân tử khác

Các kỹ thuật phân tử khác được sử dụng để phát hiện các rối loạn gen bao gồm lai huỳnh quang tại chỗ (FISH), các nghiên cứu dựa trên PCR như Q-PCR (PCR định lượng) và MLPA (Khuếch đại đầu dò phụ thuộc nhiều lần thắt - Multiple Ligation Dependent Probe Amplification). Các giao thức sử dụng giải trình tự toàn bộ bộ gen (WGS) hoặc exome (WES, giải trình tự tất cả các vùng của bộ gen mã hóa protein) có thể sẽ trở thành những lựa chọn khả thi để phát hiện các biến thể CNV.

• FISH sử dụng các đoạn ADN lớn hơn (khoảng 50 đến 200 kilobase DNA) được dán nhãn bằng thuốc thử huỳnh quang để nhắm mục tiêu vào các vùng gen cụ thể. Việc sử dụng FISH đòi hỏi kiến ​​thức về khu vực cụ thể đang được nhắm mục tiêu và phụ thuộc vào chẩn đoán lâm sàng. Nó thường được dành riêng cho các tình huống cụ thể như chuyển vị, hợp nhất hoặc khuếch đại.
• MLPA sử dụng hỗn hợp nhiều đầu dò có sẵn trong bộ dụng cụ và nhắm vào các nhiễm sắc thể hoặc vùng bệnh cụ thể. Một phản ứng duy nhất cho phép lai đồng thời nhiều mẫu dò với nhiều vùng hoặc thậm chí nhiều exon trong một gen.

Do chi phí của các mảng vi mô và các kỹ thuật phân tử khác ngày càng giảm nên FISH và MLPA ít được sử dụng hơn.

Việc tăng số lượng bản sao có thể là kết quả của sự nhân đôi nhiễm sắc thể ngay sát khu vực quan tâm, nhiễm sắc thể đánh dấu (một nhiễm sắc thể bất thường về cấu trúc) hoặc kết quả của việc chèn hoặc chuyển vị.

• Giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) là một công cụ toàn diện hơn giải trình tự toàn bộ exome (WES) để phát hiện các biến thể nucleotide đơn lẻ và nghiên cứu các bệnh nhân bị rối loạn di truyền. WGS cũng là một công cụ hiệu quả hơn để đánh giá sự hiện diện của CNV so với WES. Khi chi phí WGS giảm và việc phân tích trở nên hiệu quả hơn, kỹ thuật này có thể thay thế việc sử dụng công nghệ microarray nhiễm sắc thể. Tính hữu ích của phương pháp này đã được chứng minh trong một nghiên cứu sử dụng trình tự từ 849 cá nhân để xác định các vùng của CNV và vai trò của chúng đối với liều lượng gen. Trình tự bộ gen cũng đã được sử dụng để lập bản đồ các điểm dừng trong bộ gen chịu trách nhiệm nhân đôi các vùng nhiễm sắc thể. Trình tự có khả năng cung cấp độ phân giải được cải thiện, nhưng độ nhạy và độ đặc hiệu của trình tự để phát hiện CNV là khác nhau. WGS có thể cho phép phát hiện đồng thời các biến thể nucleotide đơn và số lượng bản sao, mặc dù chi phí nghiên cứu quá cao. Mặc dù WGS có thể phát hiện CNV một cách chính xác nhưng việc sử dụng các mảng vi mô vẫn tiếp tục là tiêu chuẩn vàng.

Như vậy có thể thấy rằng: 

Các rối loạn về gen thường được phát hiện bằng phương pháp lai gen so sánh mảng (array CGH) còn được gọi là microarray nhiễm sắc thể.

Giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS) có thể sẽ trở thành một phương pháp phổ biến để phát hiện CNV, nhưng xét nghiệm vi mảng nhiễm sắc thể vẫn là tiêu chuẩn chăm sóc. NGS có thể được thực hiện bằng cách sử dụng trình tự toàn bộ exome (WES) hoặc trình tự toàn bộ bộ gen (WGS).

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) ít được sử dụng hơn, với một số ngoại lệ như tăng số lượng bản sao và để loại trừ những bất thường về nhiễm sắc thể phức tạp hơn.

(*) Theo UptoDate