ADN tự do, hay còn gọi là cell-free DNA (cfDNA), là các phân tử ADN ngoại bào (extracellular DNA) lưu thông tự do trong máu và các chất dịch cơ thể khác, có thể được bắt nguồn từ tế bào bình thường và tế bào bị bệnh.
Nội dung:
ADN tự do là gì?
ADN tự do, hay còn gọi là cell-free DNA (cfDNA), là các phân tử ADN ngoại bào (extracellular DNA) lưu thông tự do trong máu và các chất dịch cơ thể khác, có thể được bắt nguồn từ tế bào bình thường và tế bào bị bệnh.
Sự thay đổi nồng độ, tính toàn vẹn, di truyền biểu sinh trong cfDNA có thể gợi ý các tình trạng bệnh lý của cơ thể, chẳng hạn như viêm, bệnh tự miễn, căng thẳng hoặc thậm chí là ác tính.
Phân tích ADN tự do của thai nhi trong máu mẹ cũng có thể cung cấp thông tin về các dị tật nhiễm sắc thể như trisomy 13, trisomy 8 và trisomy 21 ở thai nhi.
ADN tự do được giải phóng từ các nguồn khác nhau, bao gồm các tế bào apoptotic (apoptotic cells) trong điều kiện khỏe mạnh; hoặc các tế bào hoại tử trong ung thư; hoặc từ ADN của thai nhi trong huyết tương của mẹ.
Với các phân tử ADN tự do bắt nguồn từ tế bào khối u, một thuật ngữ khác được gán cho những phân tử ADN này, đó là “circulating tumor DNA“, viết tắt là ctDNA.
ADN tự do từ tế bào khối u (ctDNA) được tìm thấy trong huyết thanh và huyết tương từ máu. Cơ chế giải phóng ctDNA vẫn chưa được biết đến đầy đủ, mặc dù quá trình chế theo chu trình của tế bào (apoptosis), hoại tử và hoạt động bài tiết từ các tế bào khối u đã được đưa ra giả thuyết. Khi ctDNA được phân lập, những phân tử ADN tự do này có thể được giải trình tự để phân tích đột biến, qua đó hỗ trợ quá trình chẩn đoán và sàng lọc ung thư ở giai đoạn sớm.
Do đó, khả năng đo lường và định lượng chính xác ADN tự do như một dấu ấn sinh học có tiềm năng to lớn để phát hiện và theo dõi ung thư thời gian thực (sinh thiết lỏng – Liquid biopsy) và trong sàng lọc trước sinh (xét nghiệm trước sinh không xâm lấn, NIPT).
Sinh thiết lỏng, một thuật ngữ liên quan đến sinh thiết mô, là một cách kỹ thuật để phân tích mô sinh học không hợp nhất bằng cách phát hiện các tế bào và DNA tự do đi vào dịch cơ thể. Sinh thiết lỏng đề cập đến việc theo dõi thời gian thực về sự thay đổi động của bệnh bằng cách phát hiện các tế bào khối u lưu thông (CTC), ADN tuần hoàn không có tế bào (cfDNA), exosome, v.v. Kỹ thuật này có giá trị ứng dụng lớn như một công cụ chẩn đoán sớm bệnh, theo dõi tiến triển thời gian thực, quan sát và đánh giá hiệu quả chữa bệnh, đánh giá tiên lượng và phân tích rủi ro di căn, với lợi ích bổ sung là không xâm lấn và linh hoạt để lấy mẫu khối u lặp lại.
Lịch sử phát hiện ADN tự do
ADN tự do được giải phóng dưới dạng ADN chuỗi đơn và ADN sợi kép vào dịch cơ thể, bao gồm máu, đờm, nước tiểu, dịch não tủy hoặc các tế bào ung thư hoại tử.
cfDNA lần đầu tiên được xác định bởi Mandel và Metais trong máu người vào năm 1948.
Năm 1977, Leon phát hiện ra rằng các phân tử ADN tự do cũng tồn tại ở bệnh nhân ung thư.
Năm 1997, Lo et al. tìm thấy sự hiện diện của một tỷ lệ nhỏ ADN tự do của bào thai không có tế bào (cell free foetal DNA – cffDNA) có nguồn gốc từ thai nhi trong huyết tương và huyết thanh của mẹ.
Sau đó, cfDNA lần đầu tiên được sử dụng để xét nghiệm tiền sản không xâm lấn, bao gồm đánh giá giới tính thai nhi có thể xác định giới tính cho thai nhi, kiểu gen nhóm máu RhD, phát hiện dị tật nhiễm sắc thể và các bệnh liên quan đến thai nhi.
Những bệnh này bao gồm lupus ban đỏ hệ thống (SLE), một bệnh tự miễn liên quan đến nhiều hệ thống, nhiều cơ quan và nhiều tự kháng thể, và các bệnh đơn sinh, như gen β-globin và gen HBB.
Ứng dụng của ADN tự do
Là một thành phần quan trọng của kỹ thuật sinh thiết lỏng, việc phát hiện ADN tự do của thai nhi cho thấy những lợi thế không thể thay thế của kỹ thuật này trong phòng khám, bao gồm cả sự đơn giản và khả năng tiếp cận.
Phát hiện này đã đặt dấu mốc khởi đầu cho những tiến bộ mới trong lĩnh vực xét nghiệm trước sinh không xâm lấn, không gây hại tới thai kỳ, qua đó hạn chế tối đa những điểm chưa hoàn thiện của kỹ thuật chọc ối (amniocentesis).
So với sinh thiết rắn, sinh thiết lỏng bằng cách phát hiện cfDNA là không xâm lấn và dễ dàng lặp lại.
Việc phát hiện cfDNA như một điểm đánh dấu phòng khám có rất nhiều lợi thế. Các bất thường bên trong có thể được phát hiện trong cfDNA tại một thời điểm sớm hơn, do đó cho phép chẩn đoán sớm bệnh. Và việc phát hiện cfDNA giúp cho việc lấy mẫu lặp đi lặp lại có thể theo dõi tiến triển bệnh, đáp ứng thuốc và theo dõi tiên lượng.
ADN tự do của thai nhi xuất hiện từ khoảng tuần thứ 7 bảy tuần của thai kỳ và nhanh chóng bị loại bỏ sau khi sinh. Do đó, huyết tương của mẹ là sự pha trộn ADN của mẹ và thai nhi, với cffDNA chiếm tới 10% tổng số.
Các ứng dụng chẩn đoán ban đầu tập trung vào việc phát hiện các chuỗi di truyền của cha không có trong bộ gen của mẹ. Ứng dụng đầu tiên tập trung vào việc phát hiện các trình tự cụ thể của nhiễm sắc thể Y, cho phép xác định giới tính thai nhi. Điều này rất có giá trị đối với các cặp vợ chồng có nguy cơ thai nhi bị rối loạn di truyền liên kết X (X-linked genetic disorder), hoặc có nguy cơ tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh (CAH), một điều kiện mà thai nhi có thể được điều trị bằng dexamethasone để ngăn ngừa nhiễm virut.
Kích thước của ADN tự do
Các mảnh cfDNA có độ dài trung bình 170 bp và có thời gian bán hủy ngắn khoảng 15 phút cho đến vài giờ.
Một số đặc điểm của cfDNA, như nồng độ, tính ổn định và tính toàn vẹn, những nghiên cứu đã chỉ ra rằng có những khác biệt đáng kể trong các tế bào ung thư so với các tế bào bình thường.
Việc phát hiện và ứng dụng ADN tự do trong các nghiên cứu và ứng dụng lâm sàng khác nhau đã cách mạng hóa lĩnh vực nghiên cứu hệ gen (hay còn gọi là Genomics).
Độ dài của cfDNA từ bệnh nhân sẽ khác với nhóm khỏe mạnh, qua đó có thể gợi ý một số loại bệnh lý hoặc bệnh lý, bao gồm mang thai, ung thư, ghép tủy gan / xương, SLE và nhiều tình huống lâm sàng khác như đột quỵ, rối loạn tự miễn và nhồi máu cơ tim.
Độ dài của cfDNA trước đây được xác định bằng điện di gel và kính hiển vi điện tử (EM) vào năm 1998.
Nồng độ của ADN tự do
Nồng độ của cfDNA có thể thay đổi với các điều kiện sinh lý khác nhau.
Nghiên cứu mô tả nồng độ cfDNA ở bệnh nhân ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (NSCLC) cao hơn so với nhóm đối chứng khỏe mạnh và mức trung bình lần lượt là 95,67 và 59,60 ng / μl.
Nồng độ cfDNA tổng thể ở bệnh nhân ung thư có sự gia tăng đáng kể với phạm vi rộng (hàng trăm đến hàng nghìn ng/ml trong máu) so với nhóm những người khỏe mạnh (mức tương đối 30 ng/ml)
Biến thể di truyền của ADN tự do
ADN tự do tạo ra từ tế bào apoptosis hoặc tế bào hoại tử chứa các biến thể di truyền tương tự với các mô bên trong.
cfDNA được sử dụng rộng rãi như một dấu ấn sinh học di truyền để chẩn đoán và theo dõi bệnh bằng cách phát hiện các biến thể số lượng bản sao, SNPs và đột biến xảy ra trong cfDNA.
Các biến thể số lượng bản sao của ADN tự do
Các biến thể số lượng bản sao (copy-number variations, CNV) luôn liên quan tới sự xuất hiện của các rối loạn di truyền phức tạp.
CNV của cfDNA trong nước tiểu ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt tiến triển có liên quan đáng kể đến kích cỡ khối u và sự thay đổi CNV sau khi điều trị đặc hiệu giai đoạn phản ánh tình trạng tiến triển bệnh và sống sót chung.
Các biến thể số lượng bản sao của HLA-DRB5 ở 135 bệnh nhân lupus ban đỏ hệ thống (SLE) cao hơn so với 219 đối chứng khỏe mạnh và có liên quan đến nguy cơ mắc SLE.
Số bản sao ở 6p21.32 là bất thường ở phần lớn bệnh nhân SLE. Trong huyết tương của bệnh nhân u nguyên bào thần kinh, sự thay đổi số lượng bản sao của cfDNA hiển thị các mẫu cao phù hợp và có thể được sử dụng như một dấu ấn sinh học hiệu quả, không xâm lấn, nhanh chóng, mạnh mẽ và nhạy cảm để tiên lượng u nguyên bào thần kinh.
Đột biến của cfDNA
Đột biến là một hiện tượng phổ biến trong sinh học, ảnh hưởng của nó là sự thay đổi vĩnh viễn trình tự nucleotide.
Đột biến đóng một vai trò quan trọng trong cả quá trình sinh học bình thường và bất thường, chẳng hạn như tiến hóa và ung thư.
Nhiều nghiên cứu cho thấy việc phát hiện đột biến trong cfDNA sẽ cho phép chẩn đoán và theo dõi khối u không xâm lấn với độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn trước.
Nhiều bệnh nhân bị ung thư phổi tiến triển kháng với điều trị AZD9291 mang đột biến EGFR C797S trong cfDNA.
Đột biến EGFR trong cfDNA có liên quan đáng kể đến tỷ lệ sống sót chung (HĐH), sống sót không tiến triển (PFS) và đáp ứng với trị liệu trong thử nghiệm EURTAC. Các đột biến EGFR L858R trong cfDNA đã được chứng minh là một dấu hiệu tiên lượng tiểu thuyết.
Trong khối u ác tính, đột biến BRAF trong cfDNA có thể được phát hiện sớm hơn tổn thương nguyên phát.
Đột biến KRAS trong cfDNA đối với ung thư biểu mô tuyến tụy (PDAC) đã cung cấp một dấu hiệu chẩn đoán mới và có thể tối ưu hóa các chiến lược điều trị cho bệnh nhân.
SNP của cfDNA
Đa hình đơn nucleotide (Single-nucleotide polymorphism) là một biến thể trong một nucleotide đơn xảy ra trong bộ gen ở một vị trí cụ thể.
Phát hiện SNP trong ADN tự do của thai nhi đã được sử dụng rộng rãi trong sàng lọc trước sinh.
Việc phát hiện SNP nằm trong gen SRY hoặc gen TSPY trong nhiễm sắc thể Y đã được chứng minh là một dấu hiệu chẩn đoán trước sinh không xâm lấn (NIPT) chính xác và có thể áp dụng lâm sàng để xác định giới tính thai nhi.
Các nghiên cứu đã cho thấy sàng lọc dự phòng ba tháng đầu (first trimester contingent screening) sử dụng độ mờ da gáy và phân tích ADN tự do của thai nhi, sau đó có tỷ lệ phát hiện cao hơn tới 98% đối với trisomy 21, nhưng xét nghiệm tiền sản không xâm lấn sẽ không hiệu quả với truyền thống.
Kết luận
Hiện tại, cfDNA đã được sử dụng như một chỉ dấu độc lập trong sàng lọc trước sinh và cũng có giá trị ứng dụng quan trọng trong chẩn đoán và theo dõi bệnh, đặc biệt là trong ung thư.
Sự xuất hiện của cfDNA là phù hợp với xu hướng hiện tại của lĩnh vực chế tạo thuốc chính xác (precision medicine) nhằm đạt được chẩn đoán chính xác và điều trị chính xác.
Tuy nhiên, có rất nhiều thách thức để đưa vào ứng dụng đại trà tại các phòng khám xét nghiệm y khoa trong thực tế.
Có 2 lý do chủ yếu.
Thứ nhất, phương pháp được phát hiện là không đồng nhất và quá trình tiêu chuẩn hóa còn thiếu. Thứ hai, nồng độ ADN tự do có thể quá thấp, vì vậy công nghệ phát hiện cần phải được cải thiện để tăng độ nhạy và độ đặc hiệu.
Nghiên cứu về ADN tự do (cfDNA) vẫn còn ở giai đoạn phát triển ban đầu, và cần thêm nhiều hơn nữa các nghiên cứu chuyên sâu để làm rõ hơn giá trị ứng dụng lâm sàng của ADN tự do.
Tài liệu tham khảo
- Circulating free DNA (Wikipedia)
- Circulating tumor DNA (Wikipedia)
- Cell-free DNA analysis in healthy individuals by next-generation sequencing (Nature)
- Cell-Free DNA: Applications in Different Diseases (NCBI)
- Circulating Cell-Free DNA (cfDNA) (Roche)
- Circulating cell free DNA in pregnancy and cancer (NHS)
- Circulating Cell-Free DNA (INTECHOPEN)
